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【摘要】  　　本研究研制新型的血小板冷凍保存液，觀察血小板在不同保存液凍存前、后的形態改變，以及體外受凝血酶作用下的活化狀態，同時比較添加UDPGal對保存液保存效果的影響。在以往單一應用較高濃度的DMSO為血小板低溫保存液的基礎上，自行研制新型保存液：2% DMSO+ thrombosol+ UDPGal，在不同時間分別觀察血小板形態及測定血小板膜表面糖蛋白CD62P的表達。結果顯示，在圓形、樹突形、不規則形態的百分比方面冷凍保存對血小板形態有顯著影響，2% DMSO+ thrombosol組和2% DMSO+ thrombosol+ UDPGal組保護作用優于5% DMSO組；與新鮮血小板相比，凍存后血小板表達CD62P明顯下降，保存1月與3月時CD62P表達無明顯差異，3種保存液組之間CD62P表達無明顯差異。結論：3種冷凍保存液中2% DMSO+ thrombosol和2% DMSO+ thrombosol+ UDPGal對血小板形態的保持效果相似，均優于5% DMSO組。冷凍保存后血小板對凝血酶的反應下降，3種保存液組之間無明顯差異。在保存液中添加UDPGal對保存效果沒有明顯影響。

【關鍵詞】  血小板；冷凍保存；thrombosol；UDPGal；CD62P

　　Experimental Study on Cryopreservation of Plaets

        Abstract    The study was purposed to develop a novel cryopreserved agent (CPA) for plaets, to investigate the morphology of cryopreserved plaets in different CPA and  the CD62P expression on membrane of plaets after stimulating by thrombin, as well as to compare the effect of adding UDPGal on preserved efficiency of preservation solutions. A novel cryopreserved agent consisting   of 2％ DMSO, thrombosol and UDPGal was developed on  basis of using higher concentration of DMSO. The morphology of chilled plaets was observed by transmission  electron microscope and compared with fresh plaets. The expression  of CD62P    on the membrane of plaets was detected at 0, l, 3 months. The results indicated that the significant effect of cryopreservation on morphology of plaets was found  according to  percentages of round, dendritic  and irregular shapes of cryopreserved plaets. The protective effects of 2% DMSO+thrombosol and 2% DMSO+thrombosol+UDPGal were better than that of 5% DMSO. Compared with fresh plaets, the expression of CD62P on  plaet membrane decreased obviously after cryopreservation, but not observed  difference at preservation for 1 month and 3 months, as well as among 3 kinds of different CPA. It is concluded that the protective effects of 2% DMSO+thrombosol and  2% DMSO+thrombosol+UDPGal on morphology of plaets are similar, but better than that 5% DMSO. The   reaction of cryopreserved plaets to thrombin decreases, while the significant difference is not found among these 3 kinds of CPA. The addition of UDPGal to cryopreseved agents  not show the protective effect on plaets.

    Key words    plaet; lyophilized preservation; thrombosol；UDPGal；CD62P

    隨著強化療和骨髓移植的迅速開展，血小板的需求量大幅增加。然而冷凍保存后的血小板聚集功能降低，且輸注后在血循環中很快被清除［1］，極大地限制了其臨床應用。目前廣泛使用的同種異體單采血小板僅能在22℃保存5天，且存在細菌污染及10%-20％受者發生無效輸注的問題［2，3］。血小板保存時間短，采集成本高，約1/3血小板因過期被棄用，造成巨大浪費。因此，如何長期保存血小板成為醫學界面臨的難題。本研究采用2％ DMSO、thrombosol和UDPGal作為血小板冷凍保存劑，通過電子顯微鏡觀察冷凍前后血小板的形態變化，流式細胞儀檢測血小板膜表面糖蛋白CD62P的表達以反映血小板的功能，進而比較不同保護液的作用，以期為今后的臨床應用提供實驗依據。

     材料和方法

    主要試劑

    二甲亞砜（DMSO）、thrombosol試劑購自Sigma公司，UDP半乳糖（UDPGal）購自Merck公司，CD62PPE單克隆抗體及PE標記的同型單克隆抗體均購自美國Becton Dickinson公司。

    中國實驗血液學雜志  J Exp Hematol 2007; 15(2)血小板冷凍保存的實驗研究研究對象

    健康志愿者30例，他們的血小板計數不低于180×109/L，按照全國血液質量委員會頒布的供血者健康標準檢查合格。

    血小板的采集及冷凍保存

    用Cobe Spectra血細胞分離機（美國產品）采集健康人血小板30份，采集時加入枸櫞酸葡萄糖溶液1∶10抗凝，每份血小板含量約為1×1012/L。按以下方法分組保存，每組10份。A組：加5％ DMSO；B組：加2％   DMSO、thrombosol （成分為阿米洛利0.25 mmol/L、腺苷0.1  mmol/L、硝普鈉50  μmol/L）；C組：加2％  DMSO、thrombosol、UDPGal 100 μg/L。具體操作為：取30 ml血小板懸液，按組分別加入凍存劑，使其達到各組要求的終濃度，充分震蕩使血小板與凍存劑迅速混勻。每份樣本平均分為3份，1份用于立即檢測血小板，另2份置于PVC袋中，迅速用熱合儀密封，放入-80℃超低溫冰箱保存備于以后檢測。

    凍存1月時血小板形態的透射電子顯微鏡觀察

    取冷凍保存1月的各組血小板，按以下方法操作：取1滴血小板懸液鋪于有Formvar膜的銅網上，37℃溫育8分鐘，用Tyrode氏液（137 mmol/L NaCl, 2.8 mmol/L KCl, 1 mmol/L MgCl2, 12 mmol/L NaHCO3, 10 mmol/L HEPES, 0.4 mmol/L Na2HPO4, 5.5 mmol/L Dglucose, pH 7.4）反復沖洗，自然干燥后置H600I型電子顯微鏡下觀察，每個標本連續觀察200個血小板，計數圓形、樹突形和不規則形血小板的百分比。以未經凍存的新鮮血小板的電子顯微鏡觀察結果為對照。

    血小板膜表面CD62P表達的流式細胞儀檢測

    取未經凍存的新鮮血小板及凍存1月、3月時的各組血小板，按以下方法操作：將2 μl血小板懸液用TB溶液（137 mmol/L NaCl, 2.8 mmol/L KCl, 1 mmol/L MgCl2, 12 mmol/L NaHCO3, 10 mmol/L HEPES, 0.4 mmol/L Na2HPO4, 0.35% BSA, 5.5 mmol/L Dglucose, pH 7.4）稀釋至濃度為（1.0-2.0）×107/L。在聚苯乙烯試管中事先加入2.5 mmol/L GPRP和0.8 μg/ml的CD62PPE單克隆抗體，分別加入30 μl稀釋血小板和終濃度為1 U/ml的牛凝血酶，37℃孵育15分鐘以確保CD62P的表達。以PE標記的同型單克隆抗體為對照。加入等體積的1％多聚甲醛22℃固定20分鐘，再加入300 μl  TB緩沖液，用流式細胞儀585 nm波長的濾過頻帶檢測PE熒光。用流式細胞儀自帶的CellQuest軟件分析結果。

統計學分析

    采用SPSS 11.0統計軟件對數據進行ANOVAoneway LSD分析，比較不同組間的差異。結果用均數±標準差（±SD）表示。

    結    果

    透射電子顯微鏡下血小板形態變化

    低倍視野下觀察顯示：新鮮血小板形態和密度較一致，多為類圓形，內部顆粒分布均勻，結構清楚，部分活化的血小板可見有小的偽足。冷凍保存1月時的血小板形態變化較多，外形不規則，可見較多偽足，空泡增多，不同血小板間密度相差大，個別血小板內部結構消失。3種保存液凍存1月時的血小板均出現這些變化。高倍視野下觀察單個血小板的形態結構，發現冷凍后的血小板膜相對完整，顆粒減少且相對集中，空泡較多，糖原顆粒增加，聚集成堆，有細長偽足形成。5% DMSO組個別血小板內部結構*消失。結果見表1。由表1可見，不同凍存液保存的血小板構成比之間的比較顯示：圓形血小板百分比在A組減少明顯，較其他組差別顯著（P<0.01）。而B和C組與新鮮血小板相比變化不大。3組間樹突形血小板構成無顯著差異（P>0.05）。冷凍所致的不規則形血小板在A組較其他2組多（P<0.01），后兩者之間沒有明顯差異。可見冷凍對血小板形態有影響，表現為圓形血小板的減少和出現不規則形血小板，B組和C組保護作用優于A組。

    CD62P的表達

    CD62P即P選擇蛋白存在于血小板內α顆粒內膜表面，當血小板活化發生釋放反應，CD62P在血小板膜上表達，而且分泌后不會被重新攝入，因而是反應血小板活化的重要指標。冷凍可導致血小板的活化，使其復蘇后的功能受損。當再次受到刺激時活化率降低，影響其功能［4］。我們對不同低溫保存液冷凍保存1月和3月時的血小板，分別給予凝血酶刺激，通過檢測CD62P的表達來反應其活性。結果見表2、附圖。 由表2可見，①未經凍存的新鮮血小板在凝血酶刺激前、后CD62P的表達有顯著差異(P<0.001);②冷凍保存前、后（1月和3月時）的血小板在凝血酶刺激后CD62P的表達相比有顯著差異，3種保存液保存的血小板與新鮮時相比P值均<0.001。冷凍保存后的血小板（無論保存1月還是3月）在凝血酶刺激后CD62P的表達降低;③保存1月和3月時比較，各組內無顯著差異;④保存1月時各組間比較，A對B組，P=0.187；B對C組，P=0.605；A對C組，P=0.417。這些結果說明在冷凍保存1月時，3種不同保存液保存的血小板在凝血酶刺激后CD62P表達無顯著差異;⑤保存3月時各組間比較，A對B組，P=0.339；B對C組，P=0.222；A對C組，P=0.785，這些結果說明在冷凍保存3月時，3種不同保存液保存的血小板在凝血酶刺激后CD62P表達也無顯著差異。
  
　　討    論

    目前5%-6%的DMSO仍為臨床常用的血小板冷凍保存劑，但使用血小板時需洗脫DMSO以減輕其毒性［5］, 這一步驟費時費力且需要控制冷凍的速率和特殊的設備。因此國內對新的血小板保存方法進行了研究［6］。

    為了解決血小板低溫下被活化而導致無法長期保存的難題，1996年Connor等［7］研制了一種稱為thrombosol的試劑，它能與血小板內的第二信使效應物結合，特異地抑制血小板活化傳導通路。Thrombosol 由阿米洛利、腺苷、硝普鈉構成。 阿米洛利是一種離子通道阻滯劑，通過抑制Na+/H+交換有效限制Ca2+ 內流，從而減少血小板損傷。腺苷作用于血小板膜上特異性A2受體，活化腺苷酸環化酶，使cAMP和cGMP水平升高，減弱血小板的聚集。硝普鈉通過釋放NO來發揮其生物活性作用，NO可抑制血小板的黏附、聚集,且其抑制作用短暫而可逆。VadhanRaj等［8］以2% DMSO和thrombosol為血小板冷凍保存液，于-80℃低溫下保存，使血小板保存期延長至3-6個月。

    在生理狀態下，脾臟是機體破壞清除血小板的主要場所,而冷凍血小板多數在肝臟內被快速清除。血小板膜表面糖蛋白Ib（GPIb）是主要的血小板黏附受體，與血管受損處堆積的活性vWF結合，發揮黏附作用。冷凍使血小板膜上的GPIbα聚集成簇，且血小板復溫后這種構象改變仍不可逆。CR3在肝巨噬細胞膜上高表達，可識別聚集成簇GPIbα，介導肝巨噬細胞對血小板的吞噬清除。vWf、CR3與GPIbα上的不同結構域結合。用UDP半乳糖選擇性的修飾位于GPIbα寡糖鏈N端暴露的βN乙酰氨基葡萄糖殘基，既可以阻斷CR3的識別使血小板不被肝巨噬細胞吞噬，又不影響血小板的黏附功能。血小板產生的半乳糖轉移酶足夠催化半乳糖化反應，因此只需簡單加入UDPGal與血小板共同孵育即可使GPIbα被半乳糖化修飾。Hoffmeister等［1］用UDPGal修飾小鼠血小板GPIbα成功阻止血小板在體內循環被快速清除。該血小板在4℃保存12天，且不影響其功能。本實驗在低溫冷凍保存液中加入UDPGal，以期解決冷凍血小板在體內被快速清除的難題。如前所述，Hoffmeister等用UDPGal修飾小鼠冷凍血小板的實驗是在4℃下進行的，無需添加低溫保護劑。但是當低溫保護劑存在的條件下，UDPGal對其保護作用有何影響卻尚未見相關的報道。

    我們對不同低溫保存液冷凍保存的血小板用電子顯微鏡觀察其形態，發現與5%　DMSO組凍存相比，用 2%　DMSO+thrombosol組和2%　DMSO+thrombosol+UDPGal組對血小板的保護作用較優，表現為冷凍所致的不規則形血小板少，而正常圓形血小板的比例與新鮮血小板相比差別不大，后兩組之間沒有明顯差異。我們對不同凍存液保存后1、3月的血小板，給予凝血酶刺激，檢測CD62P的表達發現，與新鮮血小板相比凍存血小板受凝血酶刺激后表達CD62P均有明顯下降，與保存時間無明顯關系。對各保存液在1月與3月時前、后自身對照研究發現凝血酶刺激后CD62P的表達無明顯變化，即低溫冷凍保存的時間長短（至少3月內）對血小板功能無顯著影響。保存液5%　DMSO組、2%　DMSO+ thrombosol 組和2% DMSO+ thrombosol+UDPGal組間CD62P的表達無明顯差異。

    綜上所述，本實驗顯示2% DMSO+thrombosol及2% DMSO+thrombosol+UDPGal保存液對保持血小板形態比單用5% DMSO好，而體外功能檢測CD62P活性顯示三者無明顯差別。同時發現在保存液中添加UDPGal對保存效果沒有影響。由于5% DMSO保存液存在毒性作用需要洗脫，且冷凍保存時需控制降溫速度等缺點，與之相比2% DMSO+thrombosol保存液具有明顯優勢。而對冷凍血小板進行半乳糖化修飾更是可以解決冷凍血小板在輸注后體內快速被清除的難題，使其臨床應用不再受限。

【參考文獻】
  1 Hoffmeister KM, Felbinger TW, Falet H, et al. The clearance mechanism of chilled blood plaets. Cell, 2003; 112: 87-97

2Murphy S. Preparation and storage of plaet concentrates. In: Rossi EC, Simon TL, Moss GS, Gould SA, editors. Principles of Transfusion Medcine. 2nd ed. Baltimore: Williams & Willkins. 1996： 245-256

3Hogge DE, McConnell M, Jacobson C, et al. Plaet refractoriness and alloimmunization in pediatric oncology and bone marrow transplant patients. Transfusion, 1995; 35: 645-652

4Currie LM, Lichtiger B, Livesey SA, et al. Enhanced circulatory parameters of human plaets cryopreserved with secondmessenger effectors: an in vivo study of 16 volunteer plaet donors. Br J Haematol, 1999; 105: 826-831

5Bock M, Schleuning M, Heim MU, et al. Cryopreservation of human plaets with dimethyl sulfoxide: changes in biochemistry and cell function. Transfusion, 1995; 35: 921-924

6曹偉，王艷，靳鵬等.冷凍干燥血小板保存技術研究. 中國實驗血液學雜志，2005； 13：883-888

7Connor J, Currie LM, Allan H, et al. Recovery of in vitro functional activity of plaet concentrates stored at 4 degree C and treated with second messenger effectors. Transfusion, 1996; 36: 691-698

8VadhanRaj S, Kavanagh JJ, Freedman RS, et al. Safety and efficacy of transfusions of autologous cryopreserved plaets derived from recombinant human thrombopoietin to support chemotherapyassociated severe thrombocytopenia: a randomised crossover study. Lancet, 2002; 359(9324): 2145-2152